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      核酸的定量是微量分光光度計使用頻率很高的功能

      發布時間: 2021-06-24  點擊次數: 169次
        分光光度計是一類很重要的分析儀器,無論在物理學、化學、生物學、醫學、材料學、環境科學等科學研究領域,還是在化工、醫藥、環境檢測、冶金等現代生產與管理部門,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應用。
       
        分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器,常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
       
        超微量分光光度計已成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
       
        核酸的定量是微量分光光度計使用頻率很高的功能。
       
        可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應的系數。如:1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。
       
        測試后的吸光值經過上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實驗并非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。
       
        事實上,分光光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內變化,即儀器有一定的準確度和精確度。
       
        如德國伯赫Colibri超微量分光光度計的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩定讀數。
       
        樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。
       
        為了大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值好在0.1-1.5A。在此范圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計的測試范圍)。
       
        后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數漂移劇烈;
       
        必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的小體積等多個操作事項。
       
        除了核酸濃度,分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。
       
        純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。
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